冷冻电镜成功入选Nature methods 2015年度技术

发表时间:2016/5/27 9:22:15

    



导读:

 


每年辞旧换新之际,《自然·方法》(Nature Methods)杂志会综合当年学术界各个研究领域的技术发展情况,评选出最具代表性的十大技术方法并进行专题报道。刚刚过去的2015年,冷冻电镜(cryo-EM)技术凭借近些年突飞猛进的发展速度、革命性的技术进步(包括直接电子探测技术的发展及图像算法的优化提高)以及丰硕的科研成果,成功入选该年度的年度科学技术。目前,冷冻电镜也已逐渐发展成为研究结构生物学的主流技术手段。


正文:

 

自现代分子生物学诞生以来的半个世纪里,解析和分析生物大分子的结构、进而阐释其功能机制一直都是现代生命科学的核心问题之一。结构生物学技术的发展,已经可以观察到大分子组装形貌,证明生物分子活动机制的合理性。近几年,要获取生物大分子结构的原子级信息最广泛使用的还是通过X-射线晶体衍射,然而,这种方法受限于需要大量的样品,而且最大的瓶颈在于需要蛋白质结晶(很多情况下这很难)。另外,尽管NMR(核磁共振)并不需要结晶,但是仍然需要大量的样品以及同位素环境,并且存在尺寸限制,只能用于测试小蛋白、小RNA等。这些“经典”测试技术存在的诸多限制,阻碍了他们在大的复合物、完整的膜蛋白、聚合物以及具有多种构象的组装生物大分子等方面的应用。

所以,在结构生物学领域,如何才能够快速的获得生物大分子、蛋白质等的高分辨率的结构信息?这是该领域的很多科研人员和从业者一直不断寻求的答案。

为了解决这个难题,人们不断探索,几十年前,科学家迸发出的创新性想法:冷冻电镜单颗粒技术——通过快速冷冻的方法,使蛋白质和其所在的水溶液环境迅速转变为玻璃态(104度/秒),而蛋白质结构在玻璃态时维持其天然结构态,再通过电子显微镜用低电子剂量获取其二维透射图像,最后通过不同的计算方法将二维图像转换为三维结构图,这使得冷冻电子显微镜(cryo-EM)进入一个全新的发展阶段。但是,由于生物样品的特殊性等原因,冷冻电镜的分辨率较低,初期的冷冻电镜单颗粒结构很多时候看到的只是模糊的一团,并不能被广泛应用。

令人惊喜的是,近几年冷冻电子显微镜获得革命性飞速发展,这主要是包括硬件上直接电子探测器(Direct Detection Device,DDD)的发明和软件方面高分辨率图像处理算法的改进。这极大地提高了利用单颗粒cryo-EM的应用潜力,使得单颗粒冷冻电子显微镜(cryo-EM)逐渐成为了结构生物学领域内很多具有挑战性的课题的主要技术手段,可以快速、简易、高效、高分辨率解析高度复杂的超大生物分子结构(主要是蛋白质和核酸)。

具体来说,硬件方面,传统的电子显微镜的CCD相机都是用间接探测原理: 电子首先与闪烁体作用后转化为光子,然后由光纤耦合到高感光的CCD上成像。间接成像的转换效率很低,而且闪烁体中的光子扩散会造成电子所对应的光斑明显增大,大于成像CCD的像素点,结果大大地减弱了高分辨率时的信号。如果可以实现直接探测,在硅片上直接成像高能电子,可极大地提高分辨率,加快成像速度,并大幅度的提高电子成像的信噪比、敏感度。历经多年研究实验,终于美国加州大学圣迭戈分校的Nguyen-Huu Xuong 团队、美国劳伦斯伯克利国家实验室的Peter Denes 团队以及由Richard Henderson、Greg McMullan 和 Wasi Faruqi领导的英国医学研究委员会的分子生物学实验室(MRC)都解决了这个工程难题,并由三家公司将该技术产业化、商业化。特别值得一提的是, Direct Electron公司(中国区:苏州德锐特成像技术有限公司)作为直接电子探测器的研究先驱,在2008年研发成功世界上首个工业化的大面幅的直接电子探测器(Direct Detection Device (DDD®)),这是自2001年起,学术界与工业界密切合作经历数代芯片更迭之后得到的巅峰之作。DE公司革命里程碑式的DDD芯片,在2010年被授予“Microscopy Today Innovation Award”,同时也是美国国立卫生研究院(NIH)资助的唯一一款直接探测芯片项目。经过不断的发展和优化,直接电子探测相机(DDD)有着极低的噪音,因此,成像具有高信噪比、高分辨率的特点。另外,直接探测技术利用数据读出率高,可以使用“movie”模式进行数据收集,可以修正电子束引起的样品漂移,从而也显著提高了对比度。

探测器技术的提高,不仅实现了用更少的数据即可获得高分辨率的3D结构,而且降低了样品的尺寸限制,可以在冷冻状态下直观观察更小的含水复合物或者单个蛋白。更有意义的是,可以更好地将多相样品分类,识别并描述出许多样品的罕见相态。

软件方面,二十世纪六十年代 David DeRosier and Aaron Klug利用傅里叶变换结合分子不同角度的2D衍射图谱,得到T4噬菌体尾巴的结构可认为是从2D图片到3D结构的一次重要突破。这个过程有两点困难需要克服,分别是图片噪声及通过计算确定它们的相对方向。实验中为了减少电子辐照损伤,cryo-EM使用低电子剂量进行收据收集,而为了获得信号,每个颗粒需要平均几万到几十万张图。计算方法上,Frank和Pawel Penczek发展了“投影匹配”法,每张实验结果都要与一张由电脑模拟出的跟样品结构非常相近的3D图片进行对比,但是这种方法是比较粗糙的。后Marin van Heel舍弃几何法,而是利用每一对2D投影与3D傅里叶转换图是共享“公用线”这一事实来分析粒子图像之间的相对取向,同时,这一方法不需要倾斜样品。这些不同的图像分析方法目前已应用在不同软件包中,并得到像Spider和Imagic这样的很多冷冻电镜科研社团的广泛使用。贝勒医学院 Wah Chiu 和 Steve Ludtke研究组发展了EMAN及后来的EMAN2软件,该免费的软件包让更多的人可以轻松的进行图像处理。近年来,英国MRC实验室 Scheres 发展的软件工具RELION,由于可以处理多相样品且使用界面友好而得到全球关注,同时使得单颗粒成像分析技术很好地推广到更多科研团体研究中。

透过下图中Subramaniam教授提供的β-半乳糖苷酶的结果对比(左为早期cryo-EM结果,右为近期cryo-EM结果),就不难发现cryo-EM的分辨率在近些年取得的飞跃性的提高。



为β-半乳糖苷酶束于药物类分子苯乙基β-D-硫代半乳糖苷的结果对比(左为早年认为最好的cryo-EM结果,只能看到团状结构;右为近期结果,可以看到样品非常精细的结构,比左图分辨率提高了至少10倍)

冷冻电镜有了硬件和软件方面的双重提高,一直被诟病的分辨率得到极大的提高,甚至已与晶体学的分辨率相当。解开这个束缚,许多传统生物学研究中,因为结构未知而停滞不前的研究可以得到很好的发展,包括比如浩瀚的蛋白质家族、生物聚合体、自组装的生物结构以及复杂的生化混合物中的罕见态等等,不管对小蛋白还是大的生物分子都有了更好的发展。

生命是非常神奇的存在,这里面有繁多复杂未知未解的迷,也正是因为这样,使得生物学研究充满吸引力和非凡的意义,我们人类每一项科学技术的发展和进步,是为更好的阐释生物体的奥秘提供了利器。具体到冷冻电镜而言,它可以更好的解析复杂的生物大分子、获知蛋白结构等,从而帮助人们更好的理解生命的规律。但是正如Lawrence Berkeley National Laboratory的Robert Glaeser在Nature Methods中指出,尽管cryo-EM目前取得了很多令人激动不已的成果,但是这仍然与其物理极限有着很大的差距,我们期待在不久的将来,冷冻电镜技术能有更广泛、更深入的发展,并更好的服务于科学研究和社会发展等人类进步的方方面面。

参考文献:

[1] 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Bartesaghi A, Merk A, Banerjee S, Matthies D, Wu X, Milne JL, Subramaniam S. Science. 2015 Jun 5; 348(6239):1147-51.

[2] Method of the Year 2015. Nature Methods. 30 December 2015; 13(1).

[3] The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nogales E. Nature Methods. 30 December 2015; 13(1): 24-27.

[4] How good can cryo-EM become? Glaeser R. Nature Methods. 30 December 2015; 13(1): 28-32.



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